蛋白质互作课件.ppt

原理原理基於真核細胞轉錄因數的結構特殊性，這些轉錄因數通常需要兩個或以上相互獨立的結構域組成。分別使結合域和啟動域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在酵母細胞中表達，如果兩種蛋白可以發生相互作用，則可使結合域和啟動域在空間上充分接近，從而啟動報告基因。酵母的轉錄因數GAL4GAL4由功能上相互獨立的結構域構成，DNA結合功能域(DNAbindingdomain，DBD)和轉錄啟動結構域（activationdomain，AD）。只有當被分開的兩者通過適當的途徑在空間上較為接近時，才能重新呈現完整的GAL4轉錄因數活性，使啟動子下游基因得到轉錄。酵母雙雜交優點 1.作用信號是在融合基因表達後，在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。 2.檢測在活細胞內進行，可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。 3.檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應，因而可檢測存在於蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。 4.酵母雙雜交系統可採用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞 核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。 缺點

??自身有轉錄功能的蛋白會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結構和功能。不利於核外蛋白研究，會導致假陰性。利用酵母雙雜交發現新的蛋白質和蛋白質的新功能在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

應用2005年9月1日出版的電子版Cell上，德國科學家採用了4456個誘餌蛋白和5632個獵物蛋白，採用酵母雙雜交方法進行研究。結果，在1705種蛋白質間之間確定了3186種新的相互作用關係。同時採用免疫共沉澱和Pull-down驗證了這一結果。再通過拓撲學等評價，至少在401種蛋白質間有911種相互作用聯繫。蛋白質親和色譜????基本原理是將一種蛋白質固定於某種基質上（如Sepharose），當細胞抽提液經過改基質時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來。應用被用於蛋白質複合體的大規模篩選與化學交聯法聯合可以提高篩選效率與酵母雙雜交聯合為探討PPI的動態特性提供有意義的資訊Pull-Down技術

目的：

1.用固相化的、已標記的餌蛋白或標籤蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細胞裂解液中釣出與之互作的蛋白。2.確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關係。3.從體外轉錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用。優點1.用普通的試驗儀器和試劑（如離心機、Mini-Gel、蛋白染色）2.靈活的Pull-Down模式，鹽離子、變性劑濃度可調，對於弱蛋白相互作用也適用。3.一天之內“PullDown”和檢測可能與餌蛋白相結合的蛋白。

4.高效回收互作蛋白複合物。?缺點表位附加標記可能會使融合蛋白不穩定，改變或使融合蛋白功能喪失。?出現假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能時由蛋白質所帶電荷引起的，並不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能並不是直接的，可是由第三者作為仲介的；有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。因此實驗結果還應經其他方法驗證。免疫共沉澱

（co-immunoprecipitation）免疫共沉澱（co-IP）是以抗體和抗原之間的特異性結合為基礎，確定兩種蛋白質在完整的細胞內生理性相互作用的有效方法。優點是蛋白處於天然狀態，蛋白的相互作用可以在天然狀態下進行，可以避免認為影響；可以分離得到天然狀態下相互作用的蛋白複合體。??????????缺點：免疫共沉澱同樣不能保證沉澱的蛋白複合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。Co-Immunoprecipitation(WesternBlotorMS)HBc-YFPpEYFPFLAG-MxAWTFLAG-MxAL612KFLAG