《荧光定量PCR实验》课件.pptVIP

荧光定量PCR实验课程欢迎参加荧光定量PCR实验技术培训课程。荧光定量PCR（QuantitativePolymeraseChainReaction，qPCR）是一种在PCR扩增过程中实时检测产物合成的技术，已成为现代分子生物学研究和临床诊断的重要工具。本课程将系统介绍荧光定量PCR的基本原理、实验设计、操作技术和数据分析方法，探讨其在病毒检测、基因表达分析等领域的广泛应用。我们将从基础概念入手，逐步深入技术细节，确保您能够掌握这一强大技术的全部精髓。

背景与发展历史1983年KaryMullis发明PCR技术，为DNA体外扩增开创了新纪元，这一突破性发现使他获得了1993年诺贝尔化学奖。1992年Higuchi等人首次报道了实时PCR技术，通过在PCR反应中添加溴化乙锭来实时监测DNA扩增过程。1996年荧光染料和荧光探针被引入实时PCR，大大提高了检测的灵敏度和特异性，标志着现代荧光定量PCR技术的正式诞生。2020年COVID-19疫情期间，荧光定量PCR成为病毒检测的金标准，在全球抗疫中发挥了关键作用。

PCR基本原理变性（Denaturation）95°C高温使双链DNA解开成单链，为引物结合做准备退火（Annealing）降温至50-60°C，引物与互补的DNA序列结合延伸（Extension）72°C时，DNA聚合酶从引物开始合成新链循环重复重复以上步骤25-40次，DNA量呈指数级增长热循环仪在PCR反应中扮演着关键角色，它能够精确控制反应温度和时间，确保各步骤在最佳条件下进行。现代PCR热循环仪通常采用金属块或空气传热系统，能够在几秒钟内实现快速升温和降温，大大提高了反应效率。

荧光定量PCR的原理扩增过程与传统PCR一样，通过热循环实现DNA的指数级扩增荧光信号产生荧光染料或探针与DNA结合后发出信号，信号强度与DNA量成正比实时监测仪器在每个循环后检测荧光信号强度，绘制扩增曲线Ct值分析确定荧光信号达到阈值的循环数（Ct值），用于定量分析Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）是荧光定量PCR中最关键的参数，它表示荧光信号首次超过背景荧光的循环数。Ct值与样品中初始目标DNA或RNA的量呈负相关，即初始模板量越多，Ct值越小。通过比较不同样品的Ct值或建立标准曲线，可以实现对目标核酸的精确定量。

荧光标记方案SYBRGreen染料非特异性结合双链DNA的小分子荧光染料优点：成本低，使用简单，适用于各种目标序列缺点：会结合所有双链DNA，包括非特异性产物应用：需要通过熔解曲线分析确认产物特异性TaqMan探针5端带报告基团，3端带淬灭基团的寡核苷酸探针优点：高特异性，可用于多重PCR缺点：成本高，需要为每个靶标设计特定探针应用：精确定量，SNP检测，多重PCRFRET探针基于荧光共振能量转移原理的双探针系统优点：高特异性，背景低，可用于SNP分析缺点：设计复杂，成本高应用：高精度突变检测，等位基因分型

荧光信号的来源荧光基团激发qPCR仪器中的光源（通常是LED或激光）发出特定波长的光，激发荧光基团。被激发的荧光基团从基态跃迁到激发态，随后返回基态时释放出较长波长的荧光。不同荧光基团有特定的激发和发射波长，如FAM（494/518nm）、VIC（538/554nm）、ROX（575/602nm）等，这使得多重检测成为可能。信号检测与处理荧光检测系统通过滤光片分离出特定波长的荧光信号，再由光电倍增管或CCD检测器将光信号转换为电信号。仪器软件对信号进行处理，减去背景噪音，得到反映真实DNA量的净荧光值。在指数扩增阶段，每个循环产物量翻倍，荧光信号强度与DNA量呈线性关系，这是定量分析的理论基础。荧光信号的积累遵循PCR扩增的指数规律，但在后期由于反应组分耗尽和抑制因素积累，曲线进入平台期。只有在指数扩增期的荧光信号才能用于准确定量，这就是为什么Ct值必须设定在曲线的指数增长阶段。

核酸样品制备样品质量评估A260/A280比值，电泳检测完整性纯化处理去除PCR抑制物，如多酚、蛋白等核酸提取裂解细胞，分离纯化RNA/DNA样品收集组织、细胞、血液、拭子等RNA样品提取时需特别注意RNase的广泛存在，必须使用DEPC处理的水和RNase抑制剂。DNA样品则相对稳定，但仍需防止核酸酶的降解。无论RNA还是DNA，样品的完整性和纯度对qPCR结果都有决定性影响。理想的A260/A280比值应为1.8-2.0，低于此值表明蛋白质污染，高于此值则可能有酚或其他有机物污染。

引物设计原则专一性使用BLAST工具确保引物序列只与目标序列互补，避免非特异性扩增。理想的引物应跨越内含子或外显子交界处，以区分基因组DNA和cDNA扩增产物。适宜的Tm值正向和反向引物的Tm值差异应小于2°C，通常设计在58-6