植物组织培养中的褐变现象及其防止措施.docVIP

植物组织培养中褐变现象及其预防方法

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????摘要:细胞受损后,因为细胞区隔作用被破坏,毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞,造成组织褐变,植物组织培养过程中培养低效或失败。现在认为组织培养中褐变程度关键受外植体材料基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方法影响。在现在研究中控制褐变有效方法关键有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。?

????关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法

褐变是植物组织培养中一个普遍存在现象,是因为组织中多酚氧化酶被激活,使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质,这种褐变现象又被称为酚污染。多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶活性,从而毒害整个外植体,严重影响外植体脱分化、再分化和生长。褐变这种现象与菌类污染和过分含水化(即玻璃化)并称植物组织培养3大难题。现在褐变已成为植物组织培养发展一大障碍[1]。

1褐变现象原因

1.1非酶促褐变

非酶促褐变是因为细胞受胁迫或其她不利条件影响所造成细胞程序化死亡或自然发生细胞死亡,即坏死形成褐变现象,并不包含酚类物质产生。很多不利条件都能够造成细胞程序化死亡,但这种褐变若采取合适方法或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。?

1.2酶促褐变

多数认为,植物组织培养中褐化现象关键是由酶促褐变引发,即由多酚氧化酶(PPO,PolyphenolOxidase)作用于天然底物酚类物质而引发。在正常条件下,细胞中酚和醌之间保持一个动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织不一样部位,酚类物质分布在细胞液泡内,酶则分布在多种质体或细胞质内,这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来;但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境,或细胞受伤或衰老时,细胞膜结构或细胞中物质区域化分布破坏会造成酚氧化酶释放或合成,假如此时在适宜pH和温度等条件下,酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应,形成有毒棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。另外,组织老化或病变也可激活酚氧化酶而引发褐变。

通常认为,褐化是指外植体或培养材料接种后在组织培养过程中,因为切割造成机械损伤,伤口处分泌出酚类化合物,在有氧条件下,切面细胞中酚类物质为多酚氧化酶催化,氧化为醌,醌再经过非酶促反应产生有色物质而造成组织褐变,变成棕褐色或暗褐色,并逐步扩散到培养基中,抑制细胞内其它酶活性,影响细胞正常代谢,毒害整个组织,甚至造成组织死亡。尤其是木本植物组织外植体褐变死亡是其培养难度较大关键原因。所以,探讨褐化发生机制及其影响原因,采取有效预防褐化方法,是确保植物组织培养成功关键所在。

2影响褐变原因

2.1基因型

不一样种植物、同种植物不一样类型或品种,在组织培养中发生褐变频率和程度都存在差异。这是因为多种植物表示多酚类物质种类、含量以及酚氧化酶种类、活性存在差异,有些植物种类组织培养较易成功,有些则很困难。通常木本植物酚类化合物含量比草本植物高,所以在组培过程中更轻易发生褐变。比如在相同培养基上诱导培养,孝顺竹比小佛肚竹和风尾竹更易褐变[2]。?

2.2外植体生理状态

材料本身生理状态不一样,接种后褐变程度也不一样。通常分生部位接种后形成醌类物质少而分化部分形成醌类物质较多,褐变伴随材料组织木质化程度和年纪而增加。植物体内酚类化合物含量受到取材时间影响。比如,柿嫩芽茎尖多酚氧化酶活性显著高于休眠芽,以嫩枝茎尖为外植体进行培养时易褐变死亡[3]。同年6月份所取核桃半木质化新植茎芽萌发率高于冬季休眠芽和4月份嫩枝茎芽腋芽,且褐变率及褐变死亡率都较后二者低[4]。?

2.3外植体种类和大小

通常认为,木本植物较草本植物外植体在培养过程中更轻易发生褐变。外植体小材料,因为切口所占百分比较大而较易发生褐变。切口越大,酚类物质被氧化面积就越大,褐变程度越严重[5]。?

2.4材料预处理

材料在接种前经过一定预处理可减轻外植体在培养中褐变。预处理通常有低温或黑暗条件下预培养;外植体在水或抗氧化剂中切割或浸泡,以降低外植体与氧接触和使水溶性多酚和醌类物质充足渗出外植体。比如竹在培养时外植体在无菌水或半胱氨酸(100mg/L)溶液中浸泡2～4h有利于控制褐变[6];魔芋培养过程中,在1%柠檬酸溶液中切割外植体,可有效抑制外植体褐变;黑暗预处理能减轻蝴蝶兰R4品种叶片外植体褐变程度,其中以预处理10d褐变最轻;未经暗处理褐变最重且多酚氧化酶(PPO)活性最大[7]。?

2.5培养条件

培养过程中,低温比高温有利于抑制褐变,高温会促进酚类氧化;而低温抑制酚类合成,降低多酚氧化酶活性,降低酚类