牛SPARC基因的可选择多聚腺苷酸化在脂肪细胞增殖与分化中的功能研究.pdf

聊城大学硕士学位论文

摘要

牛肉是一种具有较高营养价值的肉类食品，在畜牧生产动物中，脂肪组织在决

定肉类感官品质方面起着至关重要的作用。脂肪组织中的肌内脂肪含量是影响肉质

的关键因素，其中功能基因在这个过程中发挥着重要作用。富含半胱氨酸的酸性分

泌蛋白(secretedproteinacidicandrichincysteine,SPARC)也被称为骨结合素它能在多,

种组织细胞中表达,以其在骨形成和组织重塑中以及癌症病理学的生理作用而闻名，

SPARC是脂肪组织的自分泌和旁分泌因子,对脂肪组织形成起到重要影响，但关于

SPARC调控前体脂肪细胞增殖分化的相关研究仍很少报道。

选择性多聚腺苷酸化(alternativecleavageandpolyadenylation,APA)是真核生物的

一个重要转录后调控方式，APA可使同一个基因产生多个具有不同3UTR的异构

体，这些异构体具有不同的mRNA稳定性、翻译效率、运输以及细胞定位。因此，

本研究选取牛SPARC基因作为目标基因，采用3RACE实验鉴定3UTR异构体,并

通过双荧光素酶报告基因和Westernblot等实验分析3UTR长短异构体表达的差异；

同时，本研究利用敲低和过表达牛SPARC基因，在分子水平探究牛SPARC基因对

牛前体脂肪细胞增殖和分化的功能和潜在调节机制。主要研究结果如下：

（1）通过3RACE实验显示,牛SPARC基因通过选择性多聚腺苷酸化,产生了

两种长短不同3UTRAPA异构体。

（2）通过双荧光素酶报告基因实验显示，在HEK293T细胞、3T3-L1细胞及牛

前脂肪细胞中，牛SPARC基因短异构体的3UTR荧光素酶活性都高于长异构体。

3qRT-PCRWesternblot3UTRSPARC

（）通过和实验显示，长、短对牛基因

具有不同的调控能力，其中短3UTR异构体转录和翻译效率显著高于长3UTR异

构体，促进了SPARCmRNA和蛋白的表达水平。

4bta-miR-29bSPARC3UTR

（）通过和带有长、短的报告基因载体共转染

HEK293T细胞，结果表明bta-miR-29b降低了SPARC长短3UTR的荧光素活性。

（5）通过bta-miR-29b和带有SPARCCDS长、短3UTR的过表达载体共转染

HEK293T细胞，结果表明bta-miR-29b降低了SPARC蛋白的表达水平。

（6）通过牛SPARC基因的过表达和敲低实验显示，在牛前脂肪细胞中过表达

或敲低SPARC基因可影响CCND1、PCNA、CDK4、CDKN1A等牛相关增殖标志

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基因的转录水平，对于牛前脂肪细胞增殖具有一定影响。

7SPARCAPA

（）通过牛前脂肪细胞中过表达牛长短异构体，结果表明短

3UTR异构体比长3UTR异构体促进牛前脂肪细胞增殖效果更显著，牛SPARC基

因的APA参与了牛前脂肪细胞增殖阶段的调控。

8OqRT-PCR

（）通过油红溶液对脂肪细胞进行染色和检测牛脂肪生成标志基

因，结果表明牛原代脂肪细胞具有较强的分化活性，SPARC基因参与牛前脂肪细胞

分化。

综上，本研究阐明了牛SPARC基因通过APA产生了长短3UTR异构体，这种

转录后的调控差异使短APA异构体有更高的表达水平，同时bta-miR-29b靶向调