核酸分子杂交.ppt

二Northern印跡雜交（一）類似於Southernblot的測定RNA分子的雜交技術稱為Northernblot（二）與Southernblot的主要區別：在變性劑存在下，以瓊脂糖電泳分離RNA（變性劑的作用是防止RNA分子形成髮夾結構，維持其單鏈線性狀態）（三）常用變性劑：乙二醛、甲醛、甲基氫氧化汞（四）轉膜：電泳結束後，不需要再進行變性和中和，直接轉膜三斑點及狹縫印跡雜交將DNA或RNA變性後直接點樣於NC膜優點：簡單、快速、可在同一張膜上進行多個樣品的檢測缺點：不能鑒別所檢測核酸的分子量，且特異性不高四原位雜交（insituhybridization）核酸保持在細胞或組織中，經適當的方法處理細胞或組織後將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交。原位雜交不需要從組織或細胞中提取核酸，能完整的保持組織與細胞的形態。細胞內原位雜交雜交反應在載玻片上進行組織切片原位雜交原位雜交的步驟：1、組織或細胞的固定用10%甲醛、4%多聚甲醛、乙醇：冰乙酸（3：1）等將組織或細胞固定在載玻片上2、雜交前的預處理目的：降解核酸表面的蛋白，提高探針的穿透力方法：蛋白酶、去垢劑（TritonX-100、SDS）注意：蛋白酶不能含有核酸酶消化時間不宜過長、否則會導致細胞結構的破壞、脫片3、探針的選擇核素標記探針：DNA、RNA、寡核苷酸探針均可非核素標記4、雜交取10-20μL雜交液滴在預處理過的玻片上，蓋上矽化蓋玻片排除氣泡，用液體石蠟或膠泥封片，以防雜交液流失。5、雜交結果檢測：同位素：放射自顯影生物素或地高辛配基標記的探針：顯色反應五液相雜交液相雜交是指待測核酸分子與核酸探針都存在於雜交液中堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子第三節探針的標記一探針的種類（一）cDNA探針：經RT-PCR可製備大量的cDNA探針cDNA探針是目前應用最廣泛的一種探針（二）基因組DNA探針：此類探針來源於染色體DNA，一般是從G-文庫中獲取或利用PCR擴增基因組中某特定片段（三）寡核苷酸探針：根據已知的核酸序列，人工合成一定長度的寡核苷酸片段（20-50個堿基的單鏈）作為探針（四）RNA探針：較少應用，可從細胞中直接提取RNA或以目的基因為範本，轉錄合成出高放射性的RNA探針二、標記物（一）核素標記物（放射性同位素）：靈敏度高，常用32P,35S,3H,125I,14C（二）非核素標記物：靈敏度低，但無放射性污染，探針標記後可長期保存（2年以上），常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶（HRP）、螢光素（FITC、羅丹明類）、化學發光劑三、標記方法主要介紹DNA探針的體外酶促標記法（一）缺口平移法（nicktranslation）1、利用DNaseⅠ在DNA雙鏈上隨機切割，造成單鏈缺口2、缺口處一個5’-末端，一個3’-末端，3’-OH可