热休克蛋白60对DF-1细胞凋亡的机制研究.pdf

聊城大学硕士学位论文

摘要

HeatshockproteinHSPs)

热休克蛋白（，，是一类在进化上高度保守，广泛存在于原核

及真核细胞内的蛋白质，主要作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输

和降解。热休克蛋白在多种肿瘤组织中表达异常且组织细胞定位与肿瘤细胞具有明显相关

性，但其具体生物学作用还需进一步研究。

本课题以DF-1细胞为研究对象，构建HSP60过表达细胞系、HSP60敲低细胞系、

HSP60敲除细胞系、HSP60MIT突变细胞系，利用ELISA和流式细胞技术检测HSP60

qPCRWesternBlotBAXBAKBcl-2

表达量改变对细胞凋亡水平的影响，利用、检测、、、

P53、Caspase3等凋亡因子的转录、表达水平，动态研究HSP60与细胞凋亡的关系。

1.过表达HSP60对细胞凋亡的影响。根据NCBI公布的HSP60序列，结合

pEGFP-C1载体序列，设计引物，构建pEGFP-HSP60重组载体，将测序正确的

pEGFP-HSP60重组载体和pEGFP-C1空载体转染DF-1细胞系，利用qPCR、Western

Blot、流式细胞等技术检测HSP60表达水平、细胞凋亡水平以及凋亡信号通路主要因子的

转录表达水平。结果表明，pEGFP-HSP60重组载体转染后，DF-1细胞HSP60转录量较

对照组增加9.57倍，表达量显著升高；过表达HSP60后，DF-1细胞凋亡水平极显著降

低；HSP60过表达后通过下调BAX、BAK表达量，上调Bcl-2表达量，使Caspase3表

达量下调，抑制细胞凋亡。

2.RNA干扰敲低HSP60对细胞凋亡的影响。设计三条HSP60-SiRNA序列和对照序

列，转染DF-1细胞系，构建HSP60敲低细胞系。结果表明：HSP60-SiRNA-1087序列

干扰效率最高，与HSP60-SiRNA-NC序列相比，HSP60蛋白表达水平降低40%。利用

qPCR、WesternBlot、流式细胞等技术检测HSP60表达水平、细胞凋亡水平以及凋亡信号

通路主要因子的转录表达水平。结果显示，敲低HSP60，BAX、Bcl-2表达量显著降低，

BAKCaspase3

、表达量极显著升高，细胞凋亡水平极显著升高。

3.敲除HSP60对细胞凋亡的影响。设计GuideRNA，构建PX459M-1-2双敲除重

组质粒，将测序正确的PX459M-1-2双敲除重组质粒转染DF-1细胞系，构建敲除HSP60

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的DF-1-HSP60-KO细胞系。结果表明，与DF-1细胞系相比，敲除HSP60后，细胞凋

BAXBcl-2BAKCaspase3HSP60

亡水平极显著升高，、表达量降低；、表达量升高。表明

敲除后通过下调BAX、Bcl-2表达量，上调BAK表达量，使Caspase3表达量上调，促

进细胞凋亡。

4.HSP60MIT突变对细胞凋亡的影响。利用Pymol进行蛋白结构预测，将HSP60

MIT起始密码子第61-63位的关键核苷酸序列CAC替换成AAG，对应的将MIT第21

位氨基酸His替换为Lys。HSP60MIT突变后，HSP60不能很好的进入线粒体发挥抗凋

亡作用，细胞凋亡水平显著升高，BAX表达水平0-2h极显著降低，3-6h极显著升高；

BAK表达水平呈现先升高后降低的趋势；Bcl-2表达水平极显著降低（p0.01）；Caspa