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胱氨酸病致病基因CTNS外显子突变的RNA剪接调控分析

摘要

研究目的

胱氨酸病是一种罕见的单基因系统性疾病，由CTNS基因变异引起。目前，越来

越多的证据表明，许多疾病中的外显子变异可以影响前体mRNA剪接。具体来说，

外显子变异改变了正确剪接所必需的调控元件，从而诱导剪接缺陷。由于缺乏与外显

子变异相关的剪接缺陷的研究，CTNS基因外显子变异对剪接调控的影响可能被低估。

本研究旨在RNA水平上分析CTNS基因中已识别的外显子变体对前体mRNA剪接的

影响。

研究方法

BDGP,MaxEntScanHSF3.1

使用生物信息学软件（和）分析人类基因突变数据库

HGMDCTNS

（）中已报道的基因的外显子变体(包括错义和无义变体)，并筛选出干

扰经典剪接位点的识别或影响外显子剪接调控元件子[剪接增强子（ESEs）和剪接沉默

子（ESSs）]的变异。接着我们通过迷你基因技术对可能诱导剪接改变的候选变异进行

了体外功能剪接测定：将构建的野生型和突变型迷你基因报告载体转染到培养细胞中

并提取分析mRNA。

研究结果

HGMD598

通过生物信息学软件分析了数据库中个外显子变异，并最终筛选出了

710113

个候选变异进行功能剪接测定。我们构建了包含，和号外显子的组野生型迷

你基因，并以此为模板构建了8个突变型迷你基因。RT-PCR分析结果表明有6个变异

体诱导了剪接改变（c.451AG，c.850CT，c.861GA，c.870CG，c.943CT和c.969CG）。

1.外显子7中的变体c.451AG产生了新的剪接转录本

生物信息学工具HSF3.1预测位于7号外显子3’端第11个核苷酸位置的错义变

体c.451AG(p.Arg151Gly)会导致6个ESEs基序的破坏并产生9个新的ESSs基序。

变体c.451AG的分析基于包含6号外显子和7号外显子的迷你基因构建体。实验结果

发现突变型迷你基因的RT-PCR产物由473bp的单个异常条带组成。测序结果表明，

c.451AG726

变体触发了隐秘剪接，导致号外显子最后的个碱基发生移码删除。

2.c.850CT10

无义变异导致外显子的显著跳跃

c.850CT(p.Gln284*)33

无义变体位于外显子’端的第个核苷酸处。生物信息学

BDGPMxEntScan5

分析表明（由和软件预测）该突变导致潜在的’供体剪接位点丢

失，得分降低。同样，HSF3.1软件的计算机分析显示，该变体改变了野生型供体位点，

因此很可能影响剪接。c.850CT的突变泳道识别出475bp和263bp的两个主要异常

转录本，表明外显子10的部分跳跃。测序结果表明较长的转录本激活了内含子10中

I

的一个隐秘供体位点。较短的转录本跳过了外显子10。PCR产物定量分析显示，与野

c.850CT10

生型质粒相比，的外显子跳跃转录本的数量显著增加。

3.c.861GA,c.870CG,c.943CTc.969CG

与野生型质粒相比，变体