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高效液相色谱法测定水杨酸及其羟基化产物

【实验目的】

掌握高效液相色谱法测定水杨酸及其羟基化产物。熟悉高效液相色谱仪的工作原理及操作方

法。

【实验原理】

本实验采用高效液相色谱法测定水杨酸及其羟基化产物，以pH4.7527.7mmol/L醋酸盐缓

液为流动相，C18色谱柱分离，电化学检测器Range=500nA,Ec=+0.85V下检测水杨酸和

2,3-DHBA，根据保留时间定性，外标法定量。

【仪器和试剂】

1．仪器：高效液相色谱仪；电化学检测器；自动进样器超纯水机等。

2．试剂：醋酸钠；冰醋酸；超纯水；水杨酸（SA）和2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）的标

准品。

【实验步骤】

一、对仪器的原理及使用进行介绍（30min）

二、样品的前处理（10min）

模拟SA与H2O2紫外汞灯光解产生的•OH发生反应：

配制含2.5µmol/LSA、2.5µmol/L2,3-DHBA待测混合混合溶液，然后用高效液相色谱测定

SA的浓度变化以及2,3-DHBA的浓度。

三、样品测定

1.仪器工作条件设置（5min）

电化学检测器Range=500nA,Ec=+0.85V；流动相为pH4.7527.7mmol/L醋酸盐缓冲液；流速：

1ml/min；温度：30℃；进样体积50μl；读数方式为峰面积。

2.工作曲线的绘制（80min）

配制标准系列：分别配制一系列浓度在0.1µmol/L～10µmol/L范围内的SA标准溶液和

0.1µmol/L～10µmol/L范围内的2,3-DHBA标准溶液。按照仪器条件进行检测，记录峰面积，

以标准系列浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

3.样品测定（30min）

按仪器测定条件测定处理好的样品中SA和2,3-DHBA的含量，以峰面积值带入绘制好的标准

曲线中计算相应待测样品中SA和2,3-DHBA的浓度。

【实验结果】

1.绘制标准曲线

SA（µmol/L）峰面积A2,3-DHBA（µmol/L）峰面积A

0.1494490.186858

0.52884010.5210396

18011561547662

5444549252934137

109556120105144874

待测样品中水杨酸峰面积A=2073310

1

待测样品中2,3-二羟基苯甲酸峰面积A=2446502

2

2.结果计算

待测样品

SA2,3-DHBA

峰面积20733102446502

浓度（µmol/L）2.204.62

【注意事项】

1.检测器基线噪音增加，灵敏度低

可能是由于流动相中溶解的气体使得压力降低而产生气泡，增加了基线噪音，造成灵敏度下

降，甚至无法分析；

规范操作：流动相使用前必须进行脱气处理（超声脱气10~20min），以除去流动相中溶解的

气体。

2.泵的维护：流动相使用高质量色谱纯（HPLC级）的，并在使用前脱气处理；每次开机后

先对泵进行清洗，使用后关机前从泵中洗去缓冲液，防止水和腐蚀性溶剂滞留在泵中。

3.色谱柱的保护：流动相使用前应根据不同的性质选用不同的滤膜（水性/油性）；样品溶

液进样前也要经过过滤，防止色谱柱的堵塞。

4.流动相的选择：对被测物质有适宜的溶解度；不与样品及固定相间发生化学反应；黏度小；；

纯度高，用前要经过过滤和除气等处理。