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实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)肖晓秋重庆医科大学生命科学研究院

2实时荧光定量PCR的几种方法介绍3实时荧光定量PCR原理1实时荧光定量PCR原理5实时荧光定量技术的应用4实时荧光定量PCR的几种方法介绍讲座提纲

实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR原理：实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理：实时原理

扩增曲线、荧光阈值、Ct值介绍三个概念：01通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析如何对起始模板定量？02实时荧光定量PCR原理：定量原理

实时荧光定量PCR原理--扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件

实时荧光定量PCR原理---荧光阈值荧光信号阈值（threshold）15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值

实时荧光定量PCR原理----Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value

实时荧光定量PCR原理--Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性

实时荧光定量PCR原理------定量原理

实时荧光定量PCR原理------定量原理

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------标准曲线

确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量

实时荧光定量PCR原理01实时荧光定量PCR的几种方法介绍02实时荧光定量PCR实验设计及应用03实时荧光定量PCR原理04实时荧光定量PCR的几种方法介绍05实时荧光定量PCR实验设计及应用06讲座提纲

非特异性荧光标记：SYBRGreen特异性荧光标记：TaqManMolecularBeacon实时荧光定量PCR原理--DNA产物的荧光标记

实时荧光定量PCR方法1--SYBRGreen法SYBRGreen

SYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位01SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。02SYBRGreen03

实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation

实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度

实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI融解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTm

SYBRGreen法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物

CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量

SYBRGreen法---PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBR