DB13_T2609-2017_禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法_河北省.docxVIP

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DB13

B41

河北省地方标准

DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR

检测方法

河北省质量技术监督局

发布

DB13/T2609—2017

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、

李丽敏、白云、韩庆安。

I

DB13/T2609—2017

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

1

范围

本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与

新城疫病毒。

2

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）

DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）

dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

3

包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0％琼

脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的

灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix。

警示:氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应

立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC

在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。

3.31.0％琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

3.7DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分

3.8反转录酶:M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）。

1

DB13/T2609—2017

3.9

RNA酶抑制剂。

3.10

2×TaqMasterMix:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

3.11dNTP。浓度为2.5mM。

3.12引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

4

仪器设备

4.1

4.2

4.3

PCR仪:温度范围4.0℃～99.9℃,样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。

凝胶成像系统:检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。

台式低温高速离心机:最高转速16000r/min；容量1.5mL×12。

4.4电泳仪:电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。

4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。

4.6冰箱:具有冷藏功能。

4.7微量移液器:单道可调,量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL～1000

μL。

4.8水浴锅:温度范围为室温～100℃。

5

以灭活的禽流感病毒与新城疫病毒鸡胚培养物或者感染禽组织作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液

将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）

的1.5mL的离心管，加盖，编号。

2

DB13/T2609—2017

剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。

5.2.4

样品储运

样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24h

内送至实验室。

5.2.5

样品的处理

5.2.5.1

棉拭子处理方法

将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件

下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

5.2.5.2

组织的处理方法

将所采集的组织至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量