简单节杆菌转化CA增强因子及操作体系的研究.pdfVIP

摘要

简单节杆菌（Arthrobactersimplex）转化醋酸可的松（Cortisoneacetate，CA）生产

PrednisoneacetatePA

醋酸泼尼松（，）的反应是工业上甾体药物生物转化的典型代表，

但其分子机制尚未完全解析，遗传操作系统尚不成熟。本文通过醋酸可的松转化过程的

蛋白表达谱分析和过表达技术筛选反应增强因子。此外，从电转条件的优化、内源启动

子的性能分析、表达系统的建立等方面对简单节杆菌遗传操作体系进行初步探索。

GO

首先分析有无底物和底物不同转化时间下的蛋白表达谱，发现在中大部分蛋白

被注释到催化活性和代谢过程，显著富集到转运活性和催化活性，COG功能均涉及I

（脂质运输和代谢）、E（氨基酸运输和新陈代谢）和C（能量生产和转化），同时这些

IPR

差异蛋白涉及脂肪酸合成与代谢、氮代谢和氨基酸代谢等代谢途径。富集的结构域

为葡萄糖/核糖醇脱氢酶，相互作用最多的功能为甾醇降解和转运。过表达技术进一步

tctAmatpscpatpntf2hrcAtfkstRkstR2ttr

证明，转运蛋白（，，，，）、转录因子（，，，，）

和氧化还原酶（no，tshk）是简单节杆菌CA转化反应增强因子。其中，ttr和scp效果最

好。此外，热激蛋白groEL、dnaK、dnaJ1、dnaJ2的过表达均能显著提高菌株的乙醇耐

受性。

之后，通过培养基成分、感受态制备温度、电击电压和电击次数以及复苏培养基等

44

3.7×10cfu/μgDNA5.9×10cfu/μgDNAgfp

参数的优化，将电转效率从提高至。以为报告

基因，分析了课题组前期基于组学数据筛选的12个内源启动子在乙醇条件下的表达特性，

PP3%96h

其中，启动子和在乙醇下培养时的相对荧光强度与无乙醇条件下相比，分

ipsibpA

别提高了59.6%和79.8%，证明乙醇促进了启动子P和P的表达活性，其活性区域分

ipsibpA

别为-1000~+1bp和-500~+1bp。

pNV18PPP

以质粒为骨架，分别构建了以和为启动子的组成型表达质粒和以

BADtacips

和P为启动子的乙醇诱导型表达质粒；并利用P和P融合表达MCas9和mCherry，

ibpABADibpA

Cas9CA

证明上述两个质粒可用于简单节杆菌中的表达。该工作为转化过程的分子机制

解析和遗传操作系统的建立提供了重要的基础数据和理论指导。

关键词：简单节杆菌；蛋白表达谱；电转优化；启动子；分子操作体系

ABSTRACT

Thereactionfromcortisoneacetate