DB21_T3084-2018_羽绒制品中鹅绒的鉴别PCR法和实时荧光PCR法_辽宁省.docxVIP

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DB21

W59

辽宁省地方标准

DB21/T3084—2018

羽绒制品中鹅绒的鉴别

PCR法和实时荧光PCR法

IdentificationofGooseDownFiberinFeatherandDownProducts

-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod

辽宁省市场监督管理局

发布

DB21/T3084—2018

前

言

本标准依据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编制。

本标准附录A、附录B为资料性附录。

本标准由中华人民共和国大连海关提出并归口。

本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：任亮、颜怀玉、孔平、王贵滨、肇慧君。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

I

DB21/T3084—2018

羽绒制品中鹅绒的鉴别PCR法和实时荧光PCR法

1

2

范围

本标准规定了羽绒制品中鹅绒的PCR和实时荧光PCR鉴别方法。

本标准适用于羽绒制品。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3

术语和定义

3.1

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物

为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性—退火—延伸的循环反应，使极少量的DNA

的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未

知模板进行定量或定性分析的方法。

4

缩略语

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

DTT：二硫疏糖醇

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用试剂盒法或其他等效DNA提取法提取样品中的DNA。针对鹅的线粒体DNA序列设计引物和探

针，通过单PCR、实时荧光PCR技术，对DNA中的鹅成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判

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DB21/T3084—2018

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试剂

6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。

6.2组织和毛发提取试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRa

Code.9765)。参见附录A中A.1。

6.3

6.4

PremixExTaq?(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)参见附录A中A.2。

100%乙醇。

6.5溴化乙锭溶液。

6.6

DNALaddarMarker。

7

设备与器具

7.1

PCR仪

7.2实时荧光定量PCR仪

7.3电泳装置

7.4凝胶成像仪

7.5冰箱：4℃~20℃

7.6天平：精度为0.0001g

7.7

7.8

7.9

分析研磨机

微孔干浴器或水浴锅

瞬时离心机

7.12微量可调移液器：0.1μL~2.5μL，1μL~10μL，2μL~20μL，10μL~100μL，20μL~200μL，

100μL~1000μL。

1.5mL离心管，2.0mL离心管

PCR薄壁管

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9

将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再次尽量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨机混匀。

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DB21/T3084—2018

称取约5mg试样，放入2mL离心管中，每个样平行提取2管，加入180μL的缓冲液GL（Buffer

GL）、20μL的蛋白酶K（ProteinaseK）和10μL的核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL），于56℃

水浴温浴至组织完全裂解3小时。如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12,000rpm离心2分

钟，去除杂质之后再进行后续操作。向裂解液中加入200μL缓冲液GB（BufferGB）和200μL100%

乙醇，充分吸打混匀。

注：温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。

10.2将核酸纯化柱（SpinColumn）安置于收集管（Collecti