DB45T 2103-2019 鸭圆环病毒检测 聚合酶链式反应法.docxVIP

ICS11.220B41

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2103—2019

鸭圆环病毒检测聚合酶链式反应法

Identificationofduckcirclevirus——PCRmethod

2019-12-25发布2020-01-30实施广西壮族自治区市场监督管理局发布

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DB45/T2103—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业农村厅提出。

本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。

本标准起草人：粟艳琼、郑敏、张步娴、莫胜兰、屈素洁、胡杰、尹彦文、邹联斌、施开创、李军。

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鸭圆环病毒检测聚合酶链式反应法

1范围

本标准规定了应用聚合酶链反应法检测鸭圆环病毒(Duckcircovirus,DuCV)的生物安全措施、

防污染措施、试剂与仪器设备、操作方法及结果判定。

本标准适用于鸭圆环病毒(Duckcircovirus,DuCV)检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

鸭圆环病毒Duckcircovirus,DuCV

属于圆环病毒科、圆环病毒属，无囊膜，单股环型DNA结构。主要是侵害宿主的免疫系统，而导致宿主免疫力低下，进而引发二重或多重感染。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2倍。

3.3

特异性引物sequencespecificprimer

与待检测的DuCV特异性引物扩增的DNA片段，两侧互补的一小段寡核苷酸。

4生物安全措施

应在兽医生物安全二级以上实验室，由具备相应资质的工作人员检测鸭圆环病毒，所有废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。

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5防污染措施

应符合NY/T541的规定。

6试剂与仪器设备

6.1试剂

6.1.1特异性引物

特异性引物引物序列参见附录A.1。上、下游引物的使用浓度均为25pmol/HL。

6.1.2DNA抽提试剂盒

商品化DNA抽提试剂盒主要成分参见附录B.2。

6.1.3PCR试剂盒

商品化PCR试剂盒主要成分参见附录B.3。

6.1.4电泳试剂

电泳试剂如下：

——DL2000DNAMARKER;——琼脂粉；

——10000×DNA染料；

——1×Tris-硼酸电泳缓冲液。注：配制方法参见附录B.4。

6.1.5其他试剂

其他试剂如下：

——1mol/L灭菌PBS(pH7.2);——DEPCH?O。

注：配制方法按附录中的B.5、B.6。

6.1.6一次性耗材

一次性耗材如下：——乳胶手套；

——离心管；

—PCR反应管；——吸头。

6.2仪器设备

仪器设备如下：—PCR仪；

——电泳仪；

——凝胶成像系统；

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——高速台式冷冻离心机；——小型高速离心机；

——水浴锅；

——乳钵或玻璃研磨器；——微量加样器；

——冰箱。

7操作方法

7.1待检样品处理

无菌采取待检鸭的肝、肾、脾、肺、法氏囊等器官组织样品各约2g,置于乳钵或玻璃研磨器中，充分研磨后，加入1mL无菌PBS(pH7.2);收集组织悬液反复冻融3次后，以3000r/min4℃离心5min,收集上清，供总DNA提取用，或置-20℃保存备用。

7.2待检样品总DNA提取

取经处理的待检样品上清200HL置于无RNA酶的1.5mL离心管中，按照DNA提取试剂盒操作说明书抽提总DNA。直接取总DNA作为模板进行PCR,或置-20℃保存备用。

7.3PCR检测

7.3.1PCR扩增

反应液总量25μL。在冰浴条