《动物生物化学》第17章核酸技术.pptx

第17章核酸技术

TechnologyofNucleicAcids;本章主要内容;对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。;生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”;;利用重组DNA技术，胰岛素原（proinsulin）的

基因在细菌中得到表达的过程;50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸工具酶有：

DNA聚合酶（DNApolymerase）

klenow片段，Taq酶

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

逆转录酶（Reversetranscriptase）

连接酶（Ligase）

拓扑异构酶（Topoisomerase）等;限制性核酸内切酶——一把神奇的“手术刀”;限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端）;;黏性末端;;基因文库建立示意图;质粒（plasmid）是常用的基因载体，为双链环状DNA，是可以独立复制并在细菌之间转移的遗传单位，质粒还能赋予宿主菌某种遗传表型，例如对于抗菌素的抗性。

;噬菌体（Phage）DNA也可以成为目的基因的载体;2.3目的基因的插入(重组)与连接

外源DNA片段与载体DNA的连接过程即DNA的重组，这一过程是以DNA连接酶为中心的生物化学过程。

连接的方式主要有粘性末端连接、平端连接、定向克隆、人工接头连接和多聚核苷酸连接等。关键是目的基因DNA和载体的缺口之间要有互补的黏性末端.

连接的原则是：实验步骤简单易行；连接点能被限制酶重新切割而便于回收插入片段；有利于重组，避免载体自身环化；对复制表达过程不产生干扰。;2.4重组载体的导入与阳性克隆的筛选

2.4.1导入方法

将重组质粒导入宿主细胞的过程称转化（transformation）

将以噬菌体、病毒构建的重组载体导入宿主细胞称转染（transfection）

对不同的宿主，导入目的基因DNA的方法不同。

一般方法有:CaCl2，电穿孔，脂质转染法等

;2.4.2重组体的筛选方法

主要??据重组体的表型进行筛选。

重组体的表型特征来自载体和插入的外源DNA两个方面。

载体的表型主要指载体携带的遗传标志，包括抗药性标志、营养标志和报道基因(reportgene)等。

抗生素抗性是生物对某种抗生素的耐受性，利用基因插入使抗性基因失活是常用的筛选方法。

鉴定目的基因或相应基因产物的方法主要有：核酸分子杂交、免疫学筛选等。

;免疫化学法筛选阳性克隆;含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过

规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）;基因重组技术的

两个基本目的

1.直接利用基因

主导生长的基因、

作物的抗性基因、

基因诊断、基因治疗、

指纹图谱等

2.利用基因的表达产物

疫苗、药物、

组织激活物、

生长因子、

珍稀蛋白等

;利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股DNA或RNA片段——探针（probe）

可以：

研究DNA之间的亲缘关系；

发现基因的缺失或突变；

测定某种遗传信息的量；

鉴定某种基因

基因治疗等;分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础

印迹技术（Blotting）

Southernblot——用探针鉴定DNA

Northernblot——用探针鉴定RNA

原位杂交（Hybridizationinsitu）

指纹分析（Fingerprinting）

基因芯片（DNAmicroarray）;;染色体的原位杂交;基因芯片的应于

发育生物学研究;在基础研究和应用领域具有广泛用途的DNA芯片;同一物种不同生态型之间DNA多态性产生的RFLP;古埃及一具木乃伊的一个

DNA片段已经得到克隆

打开了人们窥探过去的窗户;;DNA核苷酸序列分析;从上世纪90年代初开始，用了10年时间，人类完成了

对自身染色体的30亿对碱基的序列测定，这就是所谓

的人类基因组项目（HGP）;;在人类基因组