DB45T 2029-2019 甘蔗白条病菌PCR 检测技术规程.docxVIP

ICS65.020.01B16

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2029—2019

甘蔗白条病菌PCR检测技术规程

DetectingtechniqueregulationsforpathogenofXanthomonasalbilineans(Ashby)DowsonbasedonPCR

2019-12-05发布2019-12-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

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DB45/T2029—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。

本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。

本标准主要起草人员：韦金菊、刘昔辉、覃振强、张小秋、张荣华、桂意云、魏春燕、宋修鹏、李杨瑞、周珊、黄东亮、颜梅新、刘璐。

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DB45/T2029—2019

甘蔗白条病菌PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了甘蔗白条病菌（Xanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson）的PCR检测的原理、试剂、主要仪器与设备、样品的采集、保存和运输、检测方法和结果描述及判定。

本标准适用于甘蔗白条病菌[Xanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson]的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

3原理

利用甘蔗白条病病原白条黄单胞菌16-23rRNA的ITS基因设计的特异性强的引物XaAlb2-f3和XaAlb2-r3，以病原菌的DNA为模板，PCR扩增合成目的片段，从而快速、灵敏、高效地对甘蔗白条病菌（Xanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson）进行检测。

4试剂

4.1所用试剂均为分析纯试剂，实验室用水符合GB/T6682—2008中二级水指标，其中涉及PCR的用水应符合一级水指标。

4.2液氮。

4.3植物基因组DNA提取试剂盒。

4.4Goldenview核酸染料。

4.52×EasyTaqPCR反应预混液：市售产品。浓度为10mmol/L，其中含有0.05U/μLTaqDNAPolymerase、0.4MmdNTPMixture、4mMMg2+、2×PCRBuffer。

4.61×TE缓冲液。

4.71500bpDNA分子质量标准物。

4.8琼脂糖，电泳级。

4.9检测引物序列：

——上游引物XaAlb2-f3：5’-CACACACACAATACAGCATTGCGG-3’；——下游引物XaAlb2-r3：5’-CCCAACTTACTTGAGGCTATGG-3’；

——预扩增片段大小为400bp±5bp。

4.10标样：阳性对照为已确定感染甘蔗白条病菌的样品基因组DNA；阴性对照为确定未感染甘蔗白条病菌的样品基因组DNA。

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DB45/T2029—2019

5主要仪器与设备

5.1PCR扩增仪。

5.2凝胶成像系统。

5.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

5.4台式高速冷冻离心机：离心力12000g以上。

5.5恒温水浴锅。

5.6冰箱：2℃~4℃、-20℃、-80℃。

5.7高压灭菌锅。

5.8鼓风干燥箱。

5.9电子天平：感量0.001g。

5.10微量加样器：0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、20μL~200μL、50μL～1000μL。

6样品的采集、保存和运输

6.1样品采集

可采集叶片样品或蔗茎样品。叶片取最高可见肥厚带叶（+1叶）中部部位叶片的1.0g～2.0g，放置于样品袋中备用；蔗茎取成