DB45T 2026-2019 甘蔗DNA 指纹图谱采集技术规程.docxVIP

ICS65.020.01B61

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2026—2019

甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程

TechnicalregulationsforthecollectionofsugarcaneDNAfingerprint

2019-12-05发布2019-12-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

I

DB45/T2026—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并宣贯监督。本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。

本标准起草人：高轶静、周会、杨荣仲、熊发前、段维兴、张保青、杨翠芳、周珊、王泽平、张革民。

1

DB45/T2026—2019

甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程

1范围

本标准规定了甘蔗DNA指纹图谱采集的术语和定义、原理、仪器设备、操作程序及数据采集。

本标准适用于广西壮族自治区范围内保育和推广的甘蔗品系、品种、杂交种以及甘蔗种质资源的DNA指纹图谱的采集。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。2.1

简单重复序列simplesequencerepeat（SSR）

一类由几个核苷酸（一般为2～5个）为重复单位组成的简单串联重复序列。根据其保守的边界序列设计引物，可通过PCR、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。

2.2

核心引物组合coreprimercombination

指品种DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好、稳定性高、电泳峰易区分等综合特性，作为统一用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定的引物，以保证不同实验室数据具有可比性。

2.3

参照品种referencevariety

对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验数据具有可比性。本标准选择广西壮族自治区范围内的主栽品种之一ROC22和重要亲本桂糖11号作为参照品种。

3原理

由于不同甘蔗的基因组DNA存在简单重复序列的重复次数差异，这种差异可采用PCR扩增和电泳检测获得的DNA指纹对不同品种加以区分。

4仪器设备和试剂配制

仪器设备和试剂配制方法见附录A。

5操作程序

2

DB45/T2026—20195.1样品准备

每份样品至少采集两批，每批采集的样品均包括参照品种ROC22和桂糖11号；单次采集的样品独立进行实验，作为一次重复。

5.2DNA提取

取嫩叶组织约0.2g，迅速剪碎，放入盛有液氮的研钵进行充分研磨后置于离心管中，加入1mL预热至65℃的DNA提取液，65℃水浴30min，期间轻缓颠倒混匀2次；12000rpm离心20min，吸取上层清液至2mL离心管，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1），轻缓颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清液转入新的2mL离心管，再加入等体积氯仿重复抽提一次，吸取上清液至新的2mL离心管；加入等体积异丙醇，-20℃静置10min，12000rpm离心10min，弃上清液，70%酒精洗涤2次。常温干燥后加入100μLTE溶解，-20℃保存。DNA质量经OD260/280检测在1.8～2.0之间方可用于后续试验。

上述DNA提取方法为标准推荐使用，在保证DNA提取质量能够符合PCR扩增需要的前提下其它DNA提取方法均可采用。

5.3PCR扩增

5.3.1SSR引物

5对基本核心引物名单见附录B，参照品种ROC22和桂糖11号对核心引物的指纹图谱见附录C。每对引物的上游引物5’端用荧光标记。

5.3.2反应体系

PCR反应体系为20μL，其中10×PCRBuffer（含20mmol/LMg2+）2μL，dNTP（10mmol/L）0.4μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA40ng，Taq酶1U。

5.3.3反应程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃~65℃退火30s（退火温度详见附录B），72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5