生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析.pptxVIP

酵母RNA的分离、组分鉴定及含量测定

掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。01了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。02学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。03[实验目的]

1.核酸分离[原理]酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌体易收集，RNA易分离。为何选用酵母为材料提取RNA?01稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短，但RNA易分解。浓盐法:加热条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。本实验用0.2%NaOH使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。从酵母中提取RNA常用方法02

酶促水解化学水解:酸水解:碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸碱水解:RNA存在2′-OH，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸核酸水解方法2.组分鉴定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成，提取得的RNA中加10%硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液（$），分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。[原理]

磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(1mL$+1mL定磷试剂)：(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3↓(黄色)Mo6+SnCL2Mo4+Mo(MoO4)2(兰色)

核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色(1mL$+1mLFeCl3+2mLorcin→水浴加热)嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物(1mL$+过量氨水+1mL0.1M的AgNO3)。

核酸（DNA和RNA）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，吸收高峰在260nm波长处，蛋白质则在280nm波长处。纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚/氯仿抽提）3.RNA含量测定

OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD2302说明去盐不充分,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。浓度计算：DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000

[操作步骤]1．提取称取干酵母粉0.4g，放入试管中，加入0.2%NaOH3mL，然后放入沸水浴中提取15min。2．分离用自来水冷却,滴加1-4滴醋酸，调pH至6.0（沉淀蛋白质），装入离心管配平，3000r/min离心3min，（使提取液与菌体残渣分离）。3．抽提收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混匀，3500r/min离心5min。4．沉淀RNA收集上清，平均分装入两支离心管中，各加2倍体积无水乙醇，边加边搅拌，配平，3500r/min离心5min，得到RNA沉淀。弃去上清液（弃净），一支离心管加5mL蒸馏水回溶，以备浓度测定；另一支离心管加入5mL10%的H2SO4,然后转入50mL三角瓶中，待用。注意配平、对称放置离心管

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