现代微生物学实验技术.pptxVIP

绿色糖单孢菌的发酵

及胞外酶的提取北京林业大学生物科学与技术学院2012-10-20

试验目的了解发酵应用的广泛性了解利用发酵罐进行高密度培养的技术掌握发酵罐的使用原理和方法掌握酶活测定方法

绿色糖单孢菌（Saccharomonosporaviridis）是一种耐热耐碱的放线菌，产胞外木素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶。发酵：微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需的产物的过程。影响发酵的条件：培养基成分、温度、诱导时机及诱导剂、溶解氧、pH等。321试验原理

实验材料菌株：绿色糖单孢菌（Saccharomonosporaviridis）培养基种子培养基：大豆蛋白胨1%、酵母粉0.2%、酶水解酪素0.2%、氯化钠0.6%、葡萄糖1%发酵培养基：种子培养基中加入诱导物0.2%xylanpH7.8~8.0灭菌温度：115℃，30min

试验方法步骤：种子液的准备固体培养基挑取单菌落接种于种子培养基中，培养于45℃、120rpm，3d发酵培养取一定比例的种子培养基接于发酵培养基中（1:200）粗酶液提取10000rpm、4℃离心15min酶活测定木聚糖酶活xylanase

数据分析生长曲线及产酶曲线木聚糖酶的比活（包括木糖标准曲线、蛋白含量标准曲线等）

在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（2ml），分别测定其木聚糖酶和纤维素酶的比活。产酶曲线测定：生长曲线测定：在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（3ml），测定其在OD600条件下的吸光度值，至发酵结束。以同条件下未接种培养液为空白对照，培养时间为横坐标，菌液的OD600吸光度值为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在的生长曲线。生长曲线及产酶曲线

01用PH7的磷酸缓冲液分别配制浓度1mg/mL的木糖溶液。02取十支带有刻度的25mL试管，分别吸入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL木糖溶液。03加入磷酸缓冲液，使每支试管的溶液体积为1.5mL。04每支试管中加入1.0mLDNS溶液，在沸水中反应5min,反应后迅速冷却至室温。05向每支试管中加入10mL蒸馏水，在540nm处测定溶液的吸光值。制作木糖标准曲线。木聚糖酶活测定方法

粗酶液稀释10倍作为待测酶液；用pH7的磷酸缓冲液配制得到1%的木聚糖溶液作为木聚糖酶的底物，在试管中加入0.5mL底物，0.1mL酶液和0.9mL磷酸缓冲液，于60℃下水浴20min，加入1mLDNS试剂，在沸水中煮5min,冷却后加蒸馏水10mL混匀后，540nm处测定其吸光度。酶活测定方法：木聚糖酶活测定方法

蛋白含量测定方法考马斯亮蓝G-250法蛋白质浓度123456样品蛋白ml（c=0.1mg/ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水ml1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250ml555555蛋白含量μg020406080100

123菌株S.v发酵培养基：STS+xylan菌株S.v-artp1发酵培养基：STS+xylan菌株S.v-artp2发酵培养基：STS+xylan1233组分工

20上午固体平板挑去单菌落接种于STS液体培养基中活化培养；1准备好的活化液以1：200的比例接种于发酵培养基中45℃，120rpm发酵培养；2下午：16:00取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4℃300取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4℃44组分工

每天上午10:00晚上22:00以上操作共7天，10.27日上午将7天保留的样品（21个）测木聚糖酶的比活。下午16:00

谢谢！