DB21_T3493—2021_牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程_辽宁省.docxVIP

ICS65.020.30

CCSB43

21

辽宁省地方标准

DB21/T3493—2021

牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术

操作规程

辽宁省市场监督管理局

发布

DB21/T3493—2021

前

言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。

起草单位：辽宁省农业发展服务中心、辽宁省牧经种牛繁育中心有限公司。

主要起草人：李宁、刘海军、刘全、黄承俊、杜学海、李傲楠、张文军、张丽君、赵刚、周成利、

唐学成、安辉。

本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，

我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区辽河街60号），联系电话：024I

DB21/T3493—2021

牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程

1

范围

本文件规定了牛体外胚胎生产的卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎质量鉴定、

胚胎冷冻、胚胎解冻和胚胎移植的技术要求。

本文件适用于牛体外胚胎生产及移植的技术操作。

2

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4143

牛冷冻精液

GB/T5458

液氮生物容器

GB/T25881

NY/T1572

牛胚胎

牛胚胎移植技术规程

DB21/T1648

牛胚胎移植技术操作规程

3

4

使用前20min，打开风机和紫外线灯对操作台面和在超净台中使用的器材进行表面灭菌，液体操

1

DB21/T3493—2021

抗菌生理盐水（含青霉素和链霉素各0.075g/L）、采卵液、成熟液（M199）、精子洗涤液、受精

液（BO液）、胚胎培养液（CR1aa）、胚胎冷冻液、胚胎解冻液。

4.2.2

溶液配方

溶液的配方见附录A。

4.2.3

溶液的制备

4.2.3.1

基础溶液配制

按所配制溶液的配方称量药品，然后用超纯水逐一进行溶解。配制完成后调节pH值与渗透压，用0.22

μm孔径滤膜除菌，在无菌环境下装瓶封口备用。各类溶液应按要求存放及保存，不应使用变质或过期的

溶液。

4.2.3.2

成品溶液配制

根据要求或试验设计，称量好所有药品后用基础溶液进行一次性溶解，然后用0.22μm孔径滤膜除

菌备用。不用添加任何药品的成品溶液可直接使用。

5

卵母细胞的采集

活体采卵

5.1

5.1.1供体牛的选择

卵巢发育良好的空怀经产母牛。

供体牛应摄入足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及清洁的饮水，保证日粮营养全面、均衡。

于尾椎和荐椎结合处或第一与第二尾椎结合处注射2.5mL5％盐酸利多卡因进行硬膜外腔麻醉。将

带有超声波探头和采卵针（18G或21G的一次性短针头）的采卵器插入到阴道穹隆处，通过直肠把握法

将卵巢贴在探头上，在40mmHg（18G）或120mmHg（21G）负压下，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进

行穿刺。穿刺卵泡的表面直径为2mm～8mm。每头牛应单独采集，并标注好信息。采集后用采卵液洗管

3次，将收集的液体在37℃环境下，于4h内运回实验室。所用采卵液配方见附录A中A.1。

牛屠宰后30min内摘取卵巢，置于盛37℃抗菌生理盐水的保温杯中，在4h内运回实验室。如果时

间超过4h，可在4℃低温保存环境中运回实验室。

5.2.2卵母细胞的采集

2

DB21/T3493—2021

去除卵巢周围多余的组织，用37℃的抗菌生理盐水洗涤5次～6次。将洗涤好的卵巢与抗菌生理盐

水一起置于37℃的恒温加热板上备用。采卵时，用消毒的纱布包裹住卵巢，用配有18号针头的10mL

注射器从侧面穿刺，吸取表面直径2mm～8mm卵泡内的液体。可一次性将所有卵巢的卵泡液抽出，集中

捡卵；也可以每5个～6个卵巢捡卵一次。

6

卵母细胞的体外成熟

6.1

成熟液的预平衡

取卵前2h，制备好成熟盘与洗涤盘（1mL～2mL成熟液/次），于二氧化碳培养箱中预平衡，成熟

液配方见附录A中A.2。

6.2

卵母细胞的挑选

在室温下，选择形态正常、胞质均匀、周围带有致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，在成熟液中

洗涤3次～5次，备用。

6.3

卵母细胞的培养

在室温下，将洗涤好的卵丘卵母细胞复合体