DB22_T2600-2016_梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法_吉林省.docxVIP

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DB22

B45

吉林省地方标准

DB22/T2600—2016

梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法

IdentificationofSikaDeerandWapitiVelvetSlices——PolymeraseChainReaction

Method

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2600—2016

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。

本标准主要起草人：杨颖、邢秀梅、荣敏、刘敏、武薇、吴琼、徐超、徐佳萍、涂剑锋、刘汇涛、

刘华淼。

I

DB22/T2600—2016

梅花鹿、马鹿茸片鉴定方法PCR法

1范围

本标准规定了梅花鹿、马鹿茸片的PCR鉴定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果

判定、废弃物处理和防止污染的措施。

本标准适用于梅花鹿、马鹿茸片产品的真伪鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

4原理

利用梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链式反应

（PCR）技术扩增特异性DNA片段，依据是否扩增出特异性片段对鹿茸片进行鉴定。

1

DB22/T2600—2016

5.10

5.11

70%乙醇。

CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0。

5.12CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。

5.13蛋白酶K溶液（20mg/mL）。

5.14

5.15

NaCl溶液（1.2mol/L）。

TE缓冲液（Tris-Cl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH8.0）。

5.16引物

DF5

，

，

-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3

-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3

，

，

DR5

6仪器设备

6.1PCR仪。

6.2紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪。

6.3电泳仪。

6.4凝胶成像系统。

6.5电子天平：感量0.0001g。

6.6离心机：离心力≥12000rpm。

6.7涡旋振荡器。

6.8恒温水浴锅。

6.9研钵或粉碎装置。

7试验步骤

7.2.1将样品研磨后，称取200mg左右样品于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液和40μL

蛋白酶K溶液。

7.2.260℃震荡过夜后13000g离心10min，转移上清液到新的离心管中。

7.2.3加入750μL三氯甲烷后用力震荡，13000g离心5min，将上清液转移到新的离心管中。

7.2.4加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min，13000g离心15min，弃去上清液。

7.2.5加入350μLNaCL溶液将沉淀进行悬浮。再加入350μL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13000

g离心10min。

7.2.6转移上清液后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，

弃去上清液。

7.2.7加入500μL75%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200μL超纯水中。立即使用或-20℃保存备用。

7.2.8也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。

2

DB22/T2600—2016

使用紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪，分别测定260nm和280nm处吸光值（OD）为A260和A280，DNA

浓度按公式（1）计算。当A260/A280比值在1.6～1.8之间，适宜PCR扩增。

C=A×N×50.....................................(1)

1000

式中：

C——DNA浓度，为微克每微升（μg/μl）；

A——260nm处的吸光值；

N——核酸稀释倍数。

7.4PCR反应体系

PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照