DB22_T2567-2016_肺炎链球菌核酸检测PCR法_吉林省.docxVIP

ICS07.100

DB22

C04

吉林省地方标准

DB22/T2567—2016

肺炎链球菌核酸检测PCR法

PolymerasechainreactionmethodforthedetectionofStreptococcuspneumoniae

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2567—2016

前

言

本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：王慧、杨修军、张炜煜、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。

I

DB22/T2567—2016

肺炎链球菌核酸检测PCR法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了肺炎链球菌核酸检测PCR法。

本标准适用于肺炎链球菌核酸的实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

GB/T6682-2008

分析实验室用水规格和试验方法

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

3缩略语

4.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化镁

4.44dNTP（10mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP

1

DB22/T2567—2016

4.5TaqDNA聚合酶

4.6

分子量标记：100bp～2000bpDNA条带（DNALadder）

4.710×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，

溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。

4.8

琼脂糖：电泳纯

4.9

溴化乙锭

4.10

4.11

质控菌株：肺炎链球菌ATCC49619

阳性对照：肺炎链球菌ATCC49619菌体DNA

4.12肺炎链球菌种特异性引物

CpsA-F：5’-GGTGTTCTCTATCCTTGTCAGCTCTGTGTCGCTC-3’

CpsA-R：5’-GTGTGAATGGTCGAATCAACTCTAAATGCC-3’

5仪器和设备

5.1PCR仪

5.2生物安全柜

5.3涡旋混合器

5.4金属浴（或水浴锅）

5.5高压灭菌器

5.6微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL

5.7静脉采血管

6检验程序

6.1.1培养物

用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于200μL无菌双蒸水中，振荡混匀形成悬浮菌液。

6.1.3脑脊液

应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集的脑脊液（要求1mL）置于无菌、螺帽管中，并

标记。

6.1.4咽拭子

将咽拭子绕过悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3滴～5滴无菌生理盐水的试管中，待检。

2

DB22/T2567—2016

6.2

细菌DNA的提取

对于上述标本，各取0.1mL加到一个0.2mL无菌双蒸水中，振荡混匀，100℃煮沸10min，13000

rpm/min离心10min，吸取上清液即为DNA模版；使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模

板DNA。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，试剂对照。如不能及时检测，提取的DNA可置于-20℃

保存。

6.3PCR扩增

6.3.1引物

表1引物序列

菌名称

引物序列

DNA片段（bp）

657

肺炎链球菌种特异性CpsA-F:5’-GGTGTTCTCTATCCTTGTCAGCTCTGTGTCGCTC-3’

CpsA-R:5’-GTGTGAATGGTCGAATCAACTCTAAATGCC-3’

6.3.2

PCR反应体系

25μL反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP2μL，1UTaq酶，10pmol/L引物上下游各1μL，

模板DNA1μL，双蒸水补足25μL。

6.3.3PCR扩增条件

94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1