基因工程体外重组带动画.pptx

第六章DNA重组的操作

基因工程

连接？

1.克隆载体

2.表达载体

电穿孔或显微注射

扩增或表达

转化或转导

受体细胞

生命科学学院

载体DNA

生命科学学院

限制酶

限制酶—分子剪刀

—分子剪刀

第一节DNA的体外重组

粘性末端连接效率最高！

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重组DNA分子

1、粘性末端的连接

黏性末端

黏性末端

生命科学学院

生命科学学院

生命科学学院

1.粘性末端连接

创造互补粘性末端的方法有哪些？

同种酶同尾酶

第一节DNA的体外重组

生命科学学院

第一节DNA的体外重组

（1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接

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碱性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。

注意：

目的基因正反向插入；

载体与多个目的基因片段重组。

第一节DNA的体外重组

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两种不同的限制性内切酶

↓

两端会产生非互补的突出端

定向重组体

（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接

第一节DNA的体外重组

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第一节DNA的体外重组

避免了目的基因正反向插入

↓

HindIII

HindIII

↓

质粒载体的定向重组

对载体酶切

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对基因酶切

EcoRI

↓

HindIII

EcoRI

EcoRI

第一节DNA的体外重组

2.平头末端连接

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平末端平末端

SmaI限制酶

第一节DNA的体外重组

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T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。

5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。

（1）直接连接

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（2）人工加尾形成“粘性末端”

a）同聚加尾法

DNA末端转移酶

DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸,

利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。

第一节DNA的体外重组

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第一节DNA的体外重组

缺点：不能把插入片段再切下来。

非酶切位点

a）同聚加尾法

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第一节DNA的体外重组

还有哪些方法能够创造粘性末端？

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b）衔接物(linker)连接

Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。

第一节DNA的体外重组

GGAATTCCCCTTAAGG

EcoRIlinker：

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第一节DNA的体外重组

衔接物

(linker)连

接

衔接物(linker)连接

优点：

1）可以用内切酶把插入片段切下来。

2）能给载体连接上

Polylinker

缺点：

如果插入片段内部也有

该酶位点，不能切下完

整的插入片段

第一节DNA的体外重组

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c)DNA接头(adapter)连接法

adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。

adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。

5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’

第一节DNA的体外重组

BamHIadapter

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缺点：接头与接头会彼此

以粘性末端接在一起，影

响与DNA片段的连接。

防止自我连接：

•先用碱性磷酸酶（CIP）

处理接头

•以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。

第一节DNA的体外重组

DNA接头(adapter)连接法

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平头末端连接

（1）直接连接

（2）人工加尾形成“粘性末端”

a)同聚加尾法

b)衔接物连接

c)DNA接头连接法

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小结

GCAGAATTC互补序列

3’端1~20bp与模板互补；

5’端610bp是某个内切酶的识别序列（5’端多余的3~5bp属保护碱基）

3.PCR产物的连接

（1）在引物的5’端设计酶切位点

第一节重组DNA分子的构建

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5’-GCAGAATTC互补序列-3’引物1