高速逆流色谱实验讲义.docVIP

高速逆流色谱操作步骤和要点

操作步骤：

1配液。超声脱气约20min，脱气后静置冷却至室温后泵液。

2翻开恒温水浴，将温度升至设定温度。

3泵固定相。以10~20mL/min流速泵入固定相，检测器出口端流出固定相约20~50mL后停泵。

4平衡。翻开紫外检测器开始预热，正转转动主机至900rpm〔FWD为正转，REV为反转〕，同时以3mL/min流速泵入流动相，至出口端流出流动相且此时紫外信号稳定，体系根本己平衡。

5进样。以体系的上、下相溶解一定量的样品，超声溶解均匀后，在装样注射器中倒入样品溶液，将进样六通问切换至load，推排气泡后吸液至样品全进入进样圈中，将load切换至inject，检测器、工作站调零开始记录。

6接收流分。工作站记录，设备运行时间为如5min，保存后采集数据，保存。

7清洗。断开泵与主机的连接，将主机进口与气管出口连接，吹气；将主机中溶剂吹出后，泵入约50mL清洗液，吹气，重复此过程2~3次；最后一次长时间〔1小时左右直至吹干〕吹气时将主机内液体吹尽。

8关机。

操作要点：

本仪器适用于有机溶剂，316L不锈钢及PTFE材料可耐受的酸碱溶液。

1本设备可承受的压力限制为2MPa，请勿泵入不可溶解的固体颗粒。

2设备运行前先检查连接管路是否正确，是否紧密；检测器波长是否正确。

3配液时溶剂应混合均匀，自然分层澄清后可超声脱气，脱气时间不宜过长，脱气后如溶剂有温热那么最好冷却静置至室温后使用。

4样品溶解可为体系上相或下相，或同时两相溶解；不可以单一的溶剂来溶解进样，以免破坏主机内的体系平衡。

5每次做完实验请及时清洗设备，一般清洗液为甲醇、乙醇等，如体系内含有酸、碱、盐等溶剂，建议先以纯洁水清洗l~2次后，再以清洗液清洗。

6日常清洗完设备后；如需继续进行实验，请设备放置2小时后重新平衡。

7操作中如有气泡、流失或其他异常现象，可致电上海同田生物技术技术支持部0218036。

附件1：仪器性能检验

苯酚、间苯二酚的别离

体系：正已烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1：1：1.2：0.8

把溶剂按比例配制好，混合均匀后分相，上相用作固定相，下相用作流动相，分别超声脱气约20min。

样品为苯酚、间苯二酚，各30mg溶于5mL上下混合溶剂中

1、主机别离管路体积的测定

用量筒取500毫升上相，用泵泵入主机管路内，当上相从管路的出柱口流出后，继续泵至上相流出30毫升，停泵，记录下量筒内剩下的上相体积，及收集到的流出上相的体积；

总体积的计算：

V总=500-V剩余-V流出。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。〔1〕

式中：V总——管路测定总体积〔mL〕；

V剩余------泵入固定相的体积后，剩余在量筒中的体积〔mL〕；

V流出------流出固定相的体积〔mL〕。

2、固定相保存率的测定

以900rpm的转速正向旋转已被上相充满管路的主机，同时以3.00mL/min的流速往别离管路内泵入流动相，当主机出柱口管路流出流动相后，量出被流动相推出的上相体积〔V出〕；

V总

V总-V出

V总-V环

保存率=×100%。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。〔2〕

式中：V总――管路总体积〔mL〕

V出――流动相推出上相体积〔mL〕

V环――进样环的体积〔mL〕

保存率大于等于40%为合格。

3、标准峰的验证

通过六通阀往上、下相已经平衡了的管路内参加溶解好的样品，用流动相以3.00mL/min流速洗脱，直至标准峰的出现，整个过程须用色谱工作站记录谱图。

TBE-300A高速逆流色谱仪说明书

高速逆流色谱〔high-speedcountercurrentchromatography，HSCCC〕是20世纪80年代开展起来的一种连续高效的液－液分配色谱别离技术。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立的一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保存大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的别离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而防止了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，目前已广泛应用于多种领域。

HSCCC的应用领域：

1、天然产物有效成分的别离纯化;

2、多肽，蛋白质和多糖等生物大分子别离

3、抗生素的别离纯化

4、化工和化学合成物质的别离纯化

5、食品功能成分的别离纯化

6、农药残留物质别离分析

7、中药指纹图谱和质量控制研究

8、海洋生物活性成分的别离纯化

HSCCC的独特优势：

1、高效提纯；

2、大制备量；

3、低使用本钱；

4、高科研价值；

5、易工艺放大；

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