基因工程复习.ppt

基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因基因工程的材料1.质粒2.基因3.工具酶4.菌株基因工程的工具1.常规技术2.生物信息学工具基因工程的设计1.克隆方案2.酶切方案3.PCR引物基因工程具体操作的原理1.试剂的作用2.操作的要点一.质粒质粒DNA的形态与电泳行为质粒的复制类型(1)严紧型控制(2)松弛型控制质粒的不亲和性(1)质粒具有不相容性;(2)不同的不相容群的质粒可稳定共存质粒载体（改造）的基本要求:复制原点、选择标记、多克隆位点1、克隆载体（PUC)2、表达载体（pET,pGEX,pTXB1等）二.工具酶1.Ⅱ型核酸内切酶特征(1)每一种酶都有各自特异的识别序列(2)识别序列一般具有回文结构(3)切割后,产物的特点5’－pi,3’—OH(4)同位酶：(5)同尾酶:(6)同裂酶：(7)甲基化的调节(8)Star活性（星号活性）(9)位置效应酶切要点：对Na+要求不一样,缓冲液一般分成3类:【低盐（0)】【中盐（50mM】【高盐（100mM)】酶的用量不超过总体积的10%(甘油抑制酶活)双酶切：通用缓冲液查表2.连接酶催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键连接反应温度16℃Taq酶：

耐热DNA聚合酶:94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;方向:5’?3’底物:模板+引物+dNTP(还需Mg2+)反应速度:1kb/min高保真Taq酶、普通Taq酶PCR,TA克隆平端化酶Klenow酶：5`→3`聚合酶活性(合成)3`→5`外切酶活性(矫正)核酸酶S1：单链(ssDNA,ssRNA)特异性核酸酶反转录酶（1）RNA-----》DNA（2）需要引物（3）不具有纠错功能T4多核苷酸激酶----5’标记催化ATP的γ－Pi转移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化碱性磷酸化酶-------防止载体自连切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5‘磷酸基团,变成5’OH三.受体菌受体菌都是限制－修饰系统缺陷的变异株。感受态细胞的原理DH5α－－克隆菌株BL21(DE3)－－表达菌株四.生物信息资源和工具NCBI:美国国家生物技术信息中心,管理着包括GenBank在内的一批数据库BLAST:功能名称功能Blastn用核酸序列有哪些信誉好的足球投注网站核酸序列数据库Blastp用蛋白质序列有哪些信誉好的足球投注网站蛋白质序列数据库Blastx用核酸序列(翻译成蛋白质)有哪些信誉好的足球投注网站蛋白质序列数据库TBlastn用蛋白质序列(翻译成核酸)有哪些信誉好的足球投注网站核酸序列数据库Tblastx用核酸翻译的蛋白质序列有哪些信誉好的足球投注网站核酸翻译的蛋白质序列数据库FastA格式:nametttttacgVector-NTI7.1的使用ORF查找、酶谱分析、多序列比对、序列翻译、序列翻转、引物设计等五.基因工程克隆策略（1）TA克隆(2)平端克隆（3）单酶切不定向克隆载体需要脱磷，方向需筛选（4）双酶切定向克隆注意同尾酶的干扰载体MCS中的两个酶切位点间隔要远PCR，引物，表达1.PCR原理及程序设计第1步：模板变性94℃，5min第2步：30-32循环94℃,30s（模板解链）？℃，30s（引物退火,50℃-55℃）72℃，？Min（Taq酶合成延伸,1kb/min）第3步：补全不完整的dsDNA72℃，10Min2.克隆引物的设计互补序列的设计（P+,P-）酶切位点的设计载体有，基因无；有通用缓冲液；载体上不干扰；注意阅读框