DB22_T3091-2019_鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

DB22

B41

吉林省地方标准

DB22/T3091—2019

鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

Real-timePCRmethodforthedetectionofTuberculosispathogenicorganismindeer

吉林省市场监督管理厅

发布

DB22/T3091—2019

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。

本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。

I

DB22/T3091—2019

鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。

本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3

术语与定义

一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

下列缩略语适用于本文件。

以DNA为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记

跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测

样品模板的初始浓度。

1

DB22/T3091—2019

6.1试剂

除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。

6.1.1实时荧光PCR扩增所用的引物序列见表1。

表1引物序列

类别

核酸序列（5’-3’）

上游引物5’-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3’

下游引物5’-AACGACTCCGCCCCAACTG-3’

探针5’-FAM-ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3’

上游引物5’-CGGGCGTTTTGTCGCATCC-3’

下游引物5’-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3’

结核分枝杆菌

牛分枝杆菌

探针5’-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA–TAMRA-3’

6.1.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。

6.1.3Taq酶。

6.1.4磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01mol/L,pH7.4)。

6.1.50.5mol/LEDTA(pH8.0)。

6.2材料

6.2.1离心管（50mL、15mL、1.5mL）。

6.2.2吸头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。

6.2.3荧光定量PCR管。

7仪器设备

采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按GB19489和GB/T27401的有关规定执行。

9操作步骤

9.1样品的采集和保存

采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于5g。做好标识，置于密闭

容器内，冷冻或4℃冷藏保存和运输。

2

DB22/T3091—2019

9.1.2血液样品的采集和保存

使用EDTA作为抗凝剂，无菌采集静脉血不少于5mL，样品采集后于2℃～8℃冷藏保存，然后

立即运送实验室（夏季不超过24h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于-20℃冷冻保存。

样品运送时应保持冷冻状态，不应反复冻融。

9.2DNA提取

按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。

9.3对照样品

9.3.1阳性对照

取结核分枝杆菌标准菌株灭活菌，牛结核分枝杆菌灭活菌作为阳性对照。

9.3.2阴性对照

取标准阴性样品作为阴性对照。

9.3.3空白对照

去离子水。

9.4扩增反应体系

结核分枝杆菌实时荧光PCR扩增反应体系见表2。

表2结核分枝杆菌实时荧光PCR反应体系

3

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牛分枝杆菌实时荧光PCR扩增反应体系见表3。

表3牛分枝杆菌实时荧光PCR反应体系

试剂

剂量

premixExTa